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      mIHC實操寶典:熒光信號出現非特異重疊,如何改善實驗?

      發布時間:2023-08-04      點擊次數:7

      隨著多重熒光免疫組化技術的不斷發展,越來越多老師希望在自己的片子上看到更豐富的靶標信息,意味著我們需要用到更多種熒光染料去完成染色,但由于熒光染料產生的信號不是單純的線性,而是呈現山峰狀的分布,在最高點信號固然最好,但在最高點左右的一段范圍內都能夠捕獲到它的信號,那么相鄰的染料之間,難免會有信號的重疊,導致最后的結果無法被準確判讀。


      不同熒光染料光譜示意圖

       

      mIHC結果出現信號重疊,一般表現為兩種情況:

       

      1、信號重疊,沒有各自獨立信號存在(理論上指標間不存在共定位)


      圖1:左:merge;中:CD4;右:CD8

       

      2、有各自獨立的陽性信號,但大部分信號高度重疊(理論上共定位信號沒有那么多)


      圖2:左:merge;中:CD3;右:CD8


      圖3:紅箭頭:共定位信號;白箭頭:CD8信號

       

      可能原因:選用波長十分相近的熒光染料進行了染色;前一輪染色的抗體沒有洗滌干凈

       

      解決方案:

       

      1、在選擇熒光染料的時候,選擇相距波長較遠的熒光染料,以Absin的多色試劑盒為例,選擇四色(TSA520、TSA570、TSA650、DAPI)、五色(TSA520、TSA570、TSA620、TSA700、DAPI)和七色plus(TSA480、TSA520、TSA570、TSA620、TSA700、TSA770、DAPI),這幾個試劑盒里的染料之間是幾乎不會有串擾的情況。如染料TSA540跟TSA520、TSA570的熒光波長挨得十分接近,TSA650和TSA620挨得很近,在做染料選擇的時候就要避開同時應用,比如已經用了TSA520,那在同一個項目中就不要用TSA540再進行染色;如果無法避免必須要同時用,就需要掃描儀或者顯微鏡具有光譜拆分的功能,完成掃描以后再在工作站進行通道的拆分優化,但至于拆分的效果也取決于染色和成像的效果,所以為了得到一個不錯的結果,可能需要實驗者不斷地調試與優化實驗的條件。

       

      2、如果所使用的染料之間本身間隔較遠,不存在光譜重疊度過高的情況,那出現這種信號的高度重疊,多半是因為前一輪抗體沒有洗脫干凈,且前一輪的一抗來源恰好跟后一輪相同,當前一輪沒有洗干凈的時候,殘留的一抗也會跟后一輪的二抗結合,導致信號出現重疊。需要優化洗脫的條件。修復液+高壓的條件基本都能洗脫得比較干凈,但因為條件較強,很容易出現組織從片子上脫落的情況;如果是選擇修復液+微波加熱的方式,那就需要優化微波修復的條件,Absin實驗室推薦可以采用先高火煮沸修復液,取出修復盒后快速插入待洗脫/修復的切片,蓋蓋子后繼續放入微波爐低火維持15min,如果最后洗脫效果不理想,可以延長低火維持的時間,或者調整微波爐的功率,不同微波爐的火力和功率有區別,需要根據具體的實驗結果進行更改;如果是選用Absin抗體洗脫液(abs994),則需要關注沒洗干凈的指標是否是一些較難洗脫的蛋白,如結構蛋白、細胞骨架蛋白、胞漿胞核蛋白,考慮需要延長洗脫的時間或更換更強的洗脫方式(如熱修復),或者將難以洗干凈的蛋白放到最后順位去染色。

       

      3、當兩通道各自存在獨立信號,但出現大量非特異性共定位重疊信號:


      ① 如圖3所示,真正的共定位信號兩指標熒光都很強,而非特異性的共定位信號一個指標很強,另一個指標很弱,較容易區分,在不調整實驗的情況下,可以通過調整儀器的曝光時間來改善(如圖中在CD8通道出現了比較弱的CD3信號,減少CD8通道的曝光時間),因為越長的曝光時間,越容易把背景和相近通道的信號曝光出來。


      ② 避免把會存在共表達的指標搭配波長相近染料,如CD3應用了TSA570,則CD8避開使用TSA620,可以選用相距較遠的TSA700或TSA520;另外在染色的時候,根據前期預實驗的結果,微調各指標的染色條件,比如單標染色發現CD3信號非常強,CD8相對CD3弱很多,在多染的時候染CD3可以再降低抗體濃度,縮短抗體孵育時間,以及染料孵育時間,或CD8增高抗體濃度,延長孵育時間,再搭配曝光時間的調整,也能有效避免信號串擾問題。


      ③ 如果儀器可以控制拍攝不同通道的順序,相鄰的通道也可以間隔開拍攝,因為熒光信號被激發以后,在信號比較強的情況下,會在片子上留存一段時間,如果緊接著拍攝鄰近的通道,有可能這個鄰近通道也會接收到上一個通道的殘留信號,因此可以考慮間隔開拍攝。

       

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      四色多重熒光免疫組化染色試劑盒(鼠兔二抗)

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      四色多重熒光免疫組化染色試劑盒(兔二抗)

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      五色多重熒光免疫組化染色試劑盒(鼠兔二抗)

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      五色多重熒光免疫組化染色試劑盒(兔二抗)

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      六色多重熒光免疫組化染色試劑盒(兔二抗)

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      七色多重熒光免疫組化染色試劑盒(鼠兔二抗)

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      七色多重熒光免疫組化染色試劑盒(兔二抗)

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